Независимо от того, наследуется ли болезнь по одному из менделирующих типов или просто чаще встречается у родственников больных, генетический вклад в болезнь состоит из генотипических различий среди членов семьи или вызывающих болезнь, или изменяющих в ту или другую сторону восприимчивость к болезни.
Геномика , завершив исследование последовательности ДНК человека в ходе реализации проекта « », обеспечила генетиков полным списком всех генов человека, знаниями об их положении и структуре и каталогом нескольких миллионов вариантов последовательностей ДНК, обнаруженных в разных популяциях. Некоторые из этих вариантов весьма частые, другие редкие, остальные различаются по частоте в разных этнических группах.
Некоторые варианты имеют явные функциональные последствия , другие - несомненно, нейтральны. Для большинства значение для человеческого здоровья неизвестно.
Мы также очертили роль отбора и дрейфа генов , влияющих на частоту различных аллелей в популяции. В статьях на нашем сайте МедУнивер мы обсудим, как процесс мейоза, действуя во времени и в пространстве, определяет связь между генами и полиморфными локусами с их окружением.
Сначала мы представим, какую информацию о «генетическом пейзаже » генома человека дали исследования наследования генетических вариантов, а затем опишем два фундаментальных метода идентификации генов болезни. Первый метод, анализ сцепления, основан на обследовании семей.
Анализ сцепления имеет явные преимущества перед семейными родословными для определения наследования болезни в нескольких поколениях, позволяя обнаружить последовательную постоянную передачу конкретного региона генома всякий раз, когда болезнь передается в семье. Второй метод, анализ ассоциаций, основан на обследовании популяций. Анализ ассоциаций прямо не зависит от родословных, но исследует повышение или снижение частоты конкретного аллеля ил» набора аллелей в выборке больных, взятой из популяции, по сравнению с контрольной группой здоровых людей.
Анализ ассоциаций имеет преимущество перед анализом всей популяции для поиска аллелей, более или менее часто обнаруживаемых у больных по сравнению со здоровой контрольной группой.
Исследования сцепления и ассоциации для идентификации генов болезней оказало огромное влияние на понимание патогенеза и патофизиологии многих болезней. Эти знания также позволили предложить новые методы профилактики, лечения и контроля.
Как картирование генов помогает медицинской генетике?
Картирование генов болезней имеет непосредственное клиническое применение, обеспечивая информацию о позиции гена, используемую для разработки методов косвенного анализа сцепления в пренатальной и пресимптоматической диагностике и выявлении носительства.
Картирование генов болезни критически важно для начального поиска гена болезни. Картирование фокусирует внимание на ограниченном регионе генома для выполнения систематизации всех имеющихся в нем генов, так что мы можем найти мутации или варианты, которые содействуют болезни (позиционное клонирование).
Позиционное клонирование гена болезни обеспечивает возможность охарактеризовать заболевание по степени локусной гетерогенности, спектру аллельной гетерогенности, частоте различных патогенных или предрасполагающих к болезни вариантов в различных популяциях, пенетрантности и ожидаемой частоте мутаций, доле общего генетического вклада в болезнь, соотнесенных с вариантами в разных локусах и природе болезни у бессимптомных пациентов группы риска.
Описание генов и мутаций
улучшает понимание патогенеза заболеваний и способствует развитию таких направлений, как:
- чувствительная специфическая диагностика прямым обнаружением мутации;
- популяционный скрининг на носительство для выявления групп риска по болезни у обследуемых или их потомства;
- клеточные и животные модели;
- лекарственная терапия для профилактики и лечения болезни или замедления ее протекания;
- лечение заменой гена.
Картирование – самый простой способ состыковать контиги.
Картирование геномов может быть генетическое и физическое.
Генетическое картирование:
Содержит ген – фенотипический маркер;
Молекулярные маркеры:
RFLP (полиморфизм длин рестрикиционных фрагментов) –это способ исследования геномной ДНК, путем разрезания ДНК с помощью эндонуклеаз рестрикций (расщепляют нуклеиновые кислоты в середине) и дальнейший анализ образовавшихся фрагментов (рестриктов) путем гель-электрофореза;
SSLP (полиморфизм длин простых повторов)- Их есть 2 типа: минисателлиты и микросателлиты. Микросателлиты – повтор 2,3,4 н.п. Это ошибки в работе ДНК-полимеразы. Когда есть участок, где много раз повторяется олигонуклеотид, есть вероятность проскальзывания ДНК-полимеразы. Она с определенной долей вероятности может диссоциировать с матрицей и присоединиться к соседнему повтору. В результате при репликации будет либо на один повтор больше, либо на один меньше;
SNP (Полиморфизм по одиночным нуклеотидам) – отличия последовательности ДНК размеров в 1 нуклеотид в геноме представителя одного вида;
Детекция молекулярных маркеров:
1. Гибридизация ДНК:
1.1. Зонды будут спариваться с одноцепочечной ДНК, образуются полные или неполные комплементы.
1.2. Электрофорез в ПАА. Перенос с помощью нитроцеллюлозной бумаги. Радиомеченные пробы гибридизуются с ДНК. Выявляются авторадиографически.
Используется для детекции молекулярных маркеров:
1. Повторяющихся локусов;
2. Полиморфизм рестрикционных фрагментов (ПДРФ, RFLP) – обработка рестриктазой.
Типы повторов:
1. Короткие (2-4 н.) полиморфизм длин простых последовательностей (SSLP);
2. Минисателлиты (до 25 н.) VNTR;
3. Микросателлиты (ди- или тетрануклеотиды) STR, SSR;
Полиморфизм по одиночным нуклеотидам в агарозном геле (SNP);
(AGTCAG AAATC);
(AGTCAC AAATC);
Использование ДНК-чипов методом фотолитоавтографии.
Стеклянная подложка обрабатывается, на неё наносится нуклеотид. 5’-конец блокируется, освещение лазером удаляет блокирующую группировку. Так можно нанести сотни тысяч зондов.
Негибридизующиеся фрагменты отмываются; определяется по пятнам (от флуоресцентно меченной ДНК).
Недостатки:
1. Ограниченная разрешающая способность (максимум 1 ген на 3.3 кн. у E. coli и 1 ген на 10 кн. У S. cerevisiae);
2. Ограниченная разрешающая способность из-за неравномерности кроссинговера.
Основные методы физического картирования:
1. Рестрикционное картирование;
2. FiSH (флуоресцентная гибридизация in situ);
3. Картирование STS;
Рестрикционное картирование – это определение относительного расположения и определенных сайтов рестрикции на геномной карте и определение расстояний между ними.
Особенности крупных участков:
1. Использование рестриктаз, распознающих 7-8 н.;
2. Использование рестриктаз, в сайт распознавания которых входят редкие комбинации нуклеотидов;
3. Использование специальных методик гель-электрофореза с переменным электрическим полем для разделения крупных фрагментов ДНК.
Классическим походом является электрофорез для определения размеров фрагментов. Нужно как минимум 2 рестриктазы, каждая из них обрабатывает исследуемый фрагмент ДНК.
Первое что нужно сделать это подобрать рекстриктазу которая разрезает реже, чтоб получилось разумное число фрагментов. Здесь вот статистически рассчитанная частота встречаемости сайтов для различных эндонуклеаз с разным размером сайта. Берутся рестриктазы которые имеют самый длинный сайт, плюс подбираются специально еще такие рестриктазы в сайтах которых есть редкие комбинации нуклеотидов. Таким образом мы получаем реакцию рестрикции с разумным количеством фрагментов, но нужно все равно определить размер этих фрагментов. Для того чтобы определить размер крупных фрагментов используются специальные методики: либо электрофорез в переменном поле, либо другие способы визуализации которые объединяются под названием оптическое картирование.
Первое – таким образом можно найти можно найти ферменты, которые будут еще реже резать. В частности на примере генома человека, этот сайт показывает почему у нас мало CG комбинаций. В геноме человека CG буквы расположены рядом встречаются только в промоторных областях. Соответственно в большей части генома они не присутствуют. Почему так происходит? Потому что цитозин метилируется, т.е. происходит присоединение метильной группы. Был цитозин, получился 5-метилцитозин. Любая аминогруппа в составе азотистых оснований с достаточно высокой вероятностью способна гидролизоваться. Остаток от гидролиза – замена аминогруппы на оксогруппу, а если происходит замена цитозина, то мы получаем урацил который является четным основанием и соответственно системой репарации вырезается, но если это 5-метилцитозин, то мы получаем тимин, а это легальное основание в составе ДНК. Соответственно если вот буква С не критична в соответствующем месте геномной последовательности, то эволюционное давление достаточно жесткое - замена буквы С на букву Т. Эволюционное давление будет больше в кодирующей последовательности и в промоторной последовательности, потому что метилированные CG последовательности являются важным регуляторным сигналом который контролирует. Это так называемые CPGS-права там где они есть почти наверняка будет регуляторная область, которая активирована. Таким образом если задача – подобрать редкощепящие рестриктазы, то потребуется подобрать такие рестриктазы в сайт которых входят эти комбинации нуклеотиды. Давайте посмотрим что получается.
Один из вариантов это электрофорез в пульсирующем поле. Стандартный электрофорез очень плохо подходит для фрагментов с более 50 тыс. н.п. Они все собираются в кучку наверху геля, не разделяются, некоторые из них вообще остаются в лунке. Чтобы их разделить меняются условия электрофореза – два электрода меняются на 4 и напряжение подается переменное то на один электрод, то на другой. Когда подается напряжение на первый электрод фрагмент ДНК движется очень короткое расстояние, застревает в порах агарозы. Напряжение меняется, ток подается на другие электроды, фрагмент ДНК выдергивается из тех ячеек в которых он застрял и чуть-чуть двигается, потом направление опять меняется. Движение получается зигзагообразное. Но шажки очень короткие и суммируются в линейное движение. Фактически получается обычный электрофорез, разница в том что крупные фрагменты будут четко разделены, т.к. подвижность совсем другая. Не так жестко привязана к массе фрагментов. У электрофореза есть один большой недостаток – это не прямое измерение размеров ДНК. По одной из дорожек будет бежать молекулярный маркер и идет сопоставление длины пробега – косвенный показатель.
То, что называется оптическим картированием – это замена электрофорезу, здесь размер фрагментов измеряется непосредственно. Суть его заключается в том, что ДНК одним из нескольких способов распрямляется, из скрученного клубка она вытягивается. Причем вытягивается под напряжением. Причем напряжение молекулы ДНК, обрабатываются рестриктазой, после разрезания концы молекулы разъезжаются в стороны от места разреза это все можно увидеть под микроскопом. Потом такой препарат микроскопируется, ДНК окрашивается интеркалирующим флуоресцентным красителем и места разрыва видны. Прямое измерение длины под микроскопом. Два варианта получения линейные напряженные ДНК: в обоих случаях используется свойство границы между различными фазами. Когда ДНК проходит через фазовый раздел вытягивается. Первая из методик использует ДНК в растворе расплавленной агарозы. ДНК наносится на предметное стекло, через некоторое время агароза начинает застывать. Застывание никогда не идет равномерно, оно всегда начинается в каком-то месте. Фронт кристаллизации агарозы движется с начальной точки и распространяется. Когда он проходит через молекулу ДНК он тянет эту молекулу за собой и в результате мы получаем выровненную молекулу в напряженном состоянии. Потом сюда добавляется фермент, в некоторых случаях фермент сразу иммобилизован на стекле, а потом добавляются ионы магния вместе с соответствующим буфером, а может быть наоборот – потом фермент. Но лучше первый вариант – лучше диффундирует. Другой метод основан на том что покровное стеклышко очень медленно достается из раствора ДНК. Оно обрабатывается раствором силаном который увеличивает сорбцию ДНК, молекулы какой-то частью сорбируются на этом стеклышке и оно очень медленно, по паре миллиметров в час вытаскивается из раствора и когда оно проходит через пленку поверхностного натяжения молекулы ДНК вытягиваются от того места где они зафиксированы вниз. Направление противоположное движению стеклышка. Мы получаем выровненную молекулу в напряженном состоянии, потом стеклышко обрабатывается рестриктазой.
При неспаренном состоянии гибридизации нет. Детекция SNP методом гибридизации в растворе. При гибридизации шпилька раскрывается.
Следующая методика картирования флуоресцентная гибридизация на препаратах – FISH.
Здесь непосредственно визуализуется какой-нибудь локус, в соответствии с позицией флуоресцентного зонда на окрашенных цитологическим красителем препарата хромосом (скрученные хромосомы). Препарат наносится на стекло, фиксируется на нем и подвергается частичной денатурации. В результате мы получаем по длине хромосомы участки в одноцепочечном состоянии. Затее добавляется проба которая гибридизуется с этими участками, и затем такой аппарат окрашивается соответствующими красителями и микроскопируется. Микроскопия ведется в видимом диапазоне, микроскопия флуоресцентная. Проба облучается лазером в определенной длине волны и наблюдается флуоресценция. В результате мы поучаем картину флуоресценции наложенную на характерную для данной хромосомы картину полос. Мы сделали зонд под конкретный ген и сразу видим где на хромосоме этот ген расположен.
Недостатки: разрешающая способность достаточно невысокая, не более 1 млн.н. п. между соседними зонами. Чтобы повысить разрешение используются модификации методик.
Самая простая фактически ничего не меняет – механическое растяжение хромосом. Препарат хромосом крутится в центрифуге на небольших оборотах. Хромосомы вытягиваются под действием центробежных сил, главное не переборщить с оборотами. Белки не соединяются остаются в тех позициях в которых они зафиксированы и можно окрасить. Разрешение в 4-5 увеличивается. До 200 тыс.н.п. между соседними маркерами. Если нужно более высокое разрешение используются другие модификации – не метафазные хромосомы (разрешение до 20-25 тыс.н.п.) и fiber-FISH, те же самые хромосомы, только которые дополнительно растянуты – растягивание в геле, молекулярное «причесывание», разрешение до 10 тыс. н. п. Недостаток этих двух методик – мы не можем привязать флуоресцентный зонд к цитологической карте. Мы можем только расположить 2 зонда друг относительно друга и определить расстояние между зондами. Должен быть зонд позиция которого известна, и мы должны одновременно видеть и этот зонд и тот зонд который нас интересует.
Еще один способ картирования это STS-картирование. Оно чем-то похоже на генетическое картирование, но использует не рекомбинацию, а другой способ определения относительного расстояния. Критерием здесь служит частота фрагментации ДНК при построении геномных библиотек и фрагментов. Фактически суть та же самая: разрыв молекулы ДНК происходит под действием низкого ультразвука или под действием рестриктаз. отличие также в том, что служит маркерами. STS-маркеры – это известные фрагменты ДНК, которые встречаются в геноме один раз и последовательность должна быть известна.
Когда такая последовательность известна можно подобрать пару праймеров в пределе этих 100-500 н. п. и получить ПЦР фрагмент, по которому обычно такой маркер и детектируется. Самый простой способ отбора последовательностей для получения этих маркеров – это использовать EST сиквенсы это коротенькие кусочки кДНК, сделанные на матричной РНК. Поскольку это копия мРНК это она гарантированно встречается один раз в геноме, поскольку большинство генов является уникальными. Соответственно это изначально уникальная последовательность. Другие маркеры, менее удобные, маркеры полиморфные по простым последовательностям – минисателлиты или микросателлиты. Можно использовать и случайные геномные последовательности, но с ними сложнее т.к. нужно четко доказывать что они уникальные геномные последовательности. Для того, чтобы определить позицию таких маркеров нужен другой компонент – реагент картирования. Это просто набор фрагментов ДНК той или иной библиотеки. Чем маркеры ближе друг к другу на реальной карте хромосомы, тем выше вероятность, что они окажутся в одном и том же фрагменте ДНК.
Тесно сцепленные маркеры, рядом расположены соответственно они попадают в большое число фрагментов. Маркеры расположенные дальше, чаще всего попадают на разные фрагменты ДНК, Если маркеры окажутся еще дальше – расстояние между ними будет превышать размер фрагментов библиотеки, они вообще не будут детектироваться совместно. Все это статистически общипывается – можно по частоте совместного нахождения этих маркеров в библиотеке достаточно точно определить расстояние между ними на реальной карте хромосом. При условии что фрагментация лишь случайна. Источники фрагментов: стандартная клонотека, набор клеток-радиационных гибридов.
Клетки-радиационные гибриды наиболее удобны при STS-картировании. Это старая технология, фактически вариант клонирования эукариотической ДНК in vivo. Речь идет о гибридизации облученных клеток с необлученными клетками. Причем необлученные клетки, как правило, клетки китайского хомячка, а облученные – клетки любого млекопитающего в т.ч. человека. Если допустить, что это человеческие клетки, они подвергаются воздействию очень высоких доз γ-радиации и такая клетка становится нежизнеспособной, мы получаем клетку с серьезно фрагментированной ДНК и репарировать такие хромосомы невозможно. Если такую клетку слить с клеткой другого млекопитающего, то система репарации неповрежденной клетки будет пытаться репарировать эти двунитевые разрывы и результатом будет случайные включения фрагментов вот этой ДНК в различные участки своих неповрежденных хромосом. То что не удалось включить при делении клетки будет элиминировано, а то что включилось будет стандартно наследоваться в этой клеточной линии. Поскольку в каждую хромосому включается несколько фрагментов чужеродной ДНК при правильной дозе радиации достаточно около 100 клеток ста линий таких гибридом для того, чтобы построить подробную STS-карту эукариотического генома.
При помощи ПЦР зафиксируется наличие маркеров в одном образце ДНК и высчитывается частота нахождения этих маркеров во всех вариантах линий. Есть различные механизмы автоматизации.
Суть его сводится к тому, что для детекции используется не электрофорез, а флуоресцентная метка, причем эта метка достаточно хитро сюда включается. Флуоресцентные нуклеотиды добавляются в реакцию, но система детекции способна улавливать только поляризованный сигнал, изначально сигнал не поляризован – детекция не идет. Ситуация включается при включении такого нуклеотида в состав ДНК. Эти нуклеотиды являются терминирующими поэтому они включаются только один раз и после включения флуоресцируют немного по-другому. Делается ПЦР, если продукт присутствует добавляется еще один внутренний праймер; он гибридизуется с одной из цепочек продукта и к нему присоединяется этот нуклеотид. После этого сигнал оказывается поляризованным и его можно детектировать. Если продукта нет – сигнала не будет. С такой модификацией ПЦР детекции можно в масштабах эукариотического генома достаточно быстро построить физическую карту генома.
Когда мы начали разговаривать про sts-картирование, я говорил, что второй вариант источника фрагментов для картирования только стандартная клонотека. Она, немножко менее удобна в том плане, что гораздо больше клонов приходится использовать, ниже получается частота совместного нахождения на одном фрагменте, но скрининг получается более протяженный. Но, есть преимущества, которые по крайней мере частично компенсируют этот недостаток, они заключается в том, что одни и те же клоны можно использовать и для построения карты и те же самые клоны можно затем брать для секвенирования. Одну и ту же клонотеку можно использовать для картирования, а потом для определения нуклеотидной последовательности, поэтому тут не надо специально что-то конструировать, а уже имеющуюся клонотеку можно использовать для такого картирования.
Ну вам может быть рассказывали когда была цитология, про принцип fluorescence assisted cell sorting, то есть окрашивание этих клеток идет флуоресцентным красителем, то есть очень небольшая модификация этой методики позволяет открывать не клетки, а хромосомы. И этот принцип соответственно позволяет разделить весь хромосомный набор на отдельные хромосомы и затем, библиотеки делаются из ДНК одной хромосомы. Это колоссальная помощь потому что, одно дело работать в масштабе генома размером 3 млрд нуклеотидных пар, другое дело в масштабе одной хромосомы, тогда у нас получится в среднем 150 млн. Вы чувствуете, как падают масштабы и естественно этот метод используется. Я надеюсь, что вы это хорошо помните, здесь все предельно просто. То, что нужно сортировать, окрашивается флуоресцентным красителем, в данном случае хромосомы. Количество красителя, который связывается с хромосомой зависит от нескольких факторов, в первую очередь от размера хромосомы – это основной фактор, ну и во вторую очередь – это структура белков, которые связаны с этой хромосомой. Белки немножко различаются, в первую очередь различаются количеством гетерохроматина, ну это определяет то, что нет прямой корреляции между размером хромосомы и интенсивностью окрашивания. Ну, что происходит потом, потом раствор капается из пробирки маленькими каплями, каждая концентрация подобрана таким образом, чтобы капля была либо пустой, либо содержала одну хромосому, ни в коем случае не две. Затем капля сбоку освещается лучом лазера, и если в капле присутствует хромосома, то возбуждается флуоресценция, флуоресценция детектируется детектором. Интенсивность флуоресценции пропорциональна количеству красителя, который связался. Это количество характеризует каждую хромосому уникальным образом, вот на этой стадии можно сказать, какая хромосома в этой капле находится. Затем вот эта пара электродов в соответствии с интенсивностью флуоресценции заряжает каплю так, что получается достаточно мощное электрическое поле. Чем больше флуоресценция, тем больше заряд капле сообщается. Капля летит дальше, пройдя через следующую пару электродов. Эти электроды отклоняют каплю вправо или влево в соответствии с зарядом. Чем больше заряд, тем больше будет отклонение в одну сторону, в одну сторону она в общем будет отклоняться и соответственно каждая хромосома будет капать в свою пробирку. Правильный подбор красителя в случае хромосом человека позволяет таким образом раскапать все кроме одной пары хромосом по отдельным пробиркам. Для оставшейся пары хромосом берут другой краситель, который немного по другому связывается и эту пару тоже можно разделить. Таким образом, мы получаем из тотального препарата ДНК препараты отдельных хромосом, что существенно упрощает дальнейшую работу. На этом мы с картированием и библиотеками заканчиваем.
Генетическое картирование до сих пор используется и будет использоваться т.к. помимо составления карт генома у него есть важное применение – есть методика маркерсистированной селекции которая позволяет очень быстро вводить нужный ген.
Генотип такого нового сорт из дикого четко контролирует присутствие этого гена по молекулярному маркеру. Недостаток заключается в ограниченной точности. для E.coli и дрожжей генетическое картирование шло с 50х гг и была картирована тысяча генов. В случае E.coli и дрожжей максимальная плотность таких карт один ген на 3тыс.н.п. у E.coli и один ген на10 тыс.н.п. у дрожжей. И в том и в другом случае получается что удается картировать только каждый третий, каждый четвертый ген . Большей точности достигнуть не получается. Вторая проблема связана с тем что кроссинговер идет неравномерно по длине хромосомы , есть горячие точки кроссинговера, есть участки хромосомы которые блокируют кроссинговер – это вносит дополнительную ошибку и кроме того может поменять позиции некоторых локусов на генетической карте. Также из-за неаккуратности увеличивается число экспериментальных ошибок.
У картирования 2 задачи – определить относительное расположение каких-то участков на хромосоме , а вторая задача – определить расстояние между ними . Т.е. на счет относительного расположения ген картирование более или менее справляется с этим, если посмотреть на слайд позиции этих маркеров совпадают, кроме двух они переставлены местами, очевидно здесь присутствует какая-то аномалия. Что касается расстояния между маркерами, то здесь уже все несколько хуже – вы видите что некоторые расстояния оказываются несколько больше, некоторые несколько меньше чем реальные расстояния. Соответственно сейчас все больше и больше значения приобретают методики физического картирования, которые сейчас являются неотъемлемой частью геномного проекта как при классическом подходе к секвенированию, так и при шотган подходе, потому что в большинстве случаев для ликвидации пробелов на стадии финиширования все равно без карты не обойтись, особенно для эукариотических геномов.
Slide 1
Выполнила: Голубева Ю.В. 410гр
Slide 2
Одна из основных задач современной генетики
заключается в выяснении природы комплексных
признаков, к которым в частности относятся
многие распространенные болезни человека и
характеристики продуктивности
сельскохозяйственных животных. Стартовым
этапом на пути решения этого вопроса
является
Slide 3
Картирование генов -
Slide 4
Стратегические подходы
к картированию геномов
Slide 5
Стратегия прямой
генетики
Различия во времени появления,
необходимой методической базой и
спектре возможностей. Функция гена
известна хотя бы частично.
Slide 6
Функциональное
картирование
Основа - наличие некоторой информации о
биохимическом полиморфизме, лежащем в
основе того или иного наследственного
признака.
начинается с выделения в чистом виде
белкового продукта гена.
к нему по аминокислотной последовательности
подбирают вырожденные праймеры
проводят ПЦР-скрининг
Slide 7
Большинство генов, функция которых
была известна, уже клонированы и
локализованы.
Slide 8
Для большинства генов, которые
были локализованы, характерны
структурные аномалии (как
правило, это гены, ответственные за
наследственные заболевания
человека), что существенно
облегчает заключительную стадию
поиска гена - выделение и
локализацию гена.
Slide 9
Кандидатное
картирование
информация о функциональном
изменении недостаточно полна, чтобы
точно указать ген
Информации достаточна для того,
чтобы выдвинуть предположения о
возможных кандидатах либо по их
функции, либо по положению на
хромосоме
Slide 10
Общее:
при функциональном, и при
кандидатном подходе клонирование
гена, как правило, предшествует его
точной локализации в геноме
локализовать ген означает пройти путь
от его функции к локализации на
хромосоме (позиции)
Slide 11
Стратегия обратной
генетики
От хромосомной карты к функции
гена. Возникло благодаря появление в
конце 80-х годов множества
высокополиморфных ДНК-маркеров
Slide 12
Позиционное
картирование
локализация гена при отсутствии всякой
функциональной информации о нем
место гена на карте устанавливают по
результатам анализа его сцепления с
ранее локализованными генетическими
маркерами, далее исследуется уже
область генома рядом с маркером
Slide 13
Генетический маркёр
(genetic marker)
Ген, детерминирующий
отчетливо выраженный
фенотипический признак,
используемый для
генетического картирования
и индивидуальной
идентификации организмов
или клеток. Также в качестве
генетических маркеров
могут служить целые
(маркерные) хромосомы.
Slide 14
Минусы
ограничением позиционного
подхода является низкая
разрешающая способность
генетических карт - интервал между
двумя соседними маркерами, в
котором локализован ген, может
оказаться слишком велик и
недоступен физическому
картированию.
Slide 15
Картирование генов –
виды
Физическое картирование
Генетическое картирование
Цитогенетическое(цитологическое)
картирование
Slide 16
Физическое
картирование
обширная группа методов, позволяющая строить
карты генома (обычно их называют физическими)
высокого уровня разрешения и определять
расстояния между локализуемыми нуклеотидными
последовательностями с точностью от нескольких
десятков тысяч п.н. до одной нуклеотидной пары.
Пример: картирование
генов с помощью
хромосомных мутаций
Slide 17
Типы физического
картирования
рестрикционное картирование
RH-картирование
клонирование в YAC (от англ. yeast artificial
chromosome)
BAC (от англ. bacterial artificial
chromosome) в космидах, плазмидах и
других векторах и контиг-картирование на
их основе
секвенирование ДНК
Slide 18
В том случае, когда известна
последовательность ДНК интересующего
локуса, эту последовательность можно
использовать для гибридизации с
хромосомами in situ, и место гибридизации
будет однозначно указывать на локализацию
локуса в определенном районе определенной
же хромосомы
Slide 19
Генетическое
картирование
картирование, основанное
на методах классической
генетики - определении
групп сцепления, частоты
рекомбинации и
построении генетических
карт, где единицей
измерения служат
проценты рекомбинации
Slide 20
Первый ген человека
был локализован на
Х-хромосоме в 1911
г.
Первый аутосомный
ген - только в 1968 г
Slide 21
Генетическая карта
(genetic map
Схема взаимного
расположения генов на
хромосоме (в группе
сцепления) и их
распределения по
разным хромосомам,
как правило,
включающая данные об
относительном
удалении генов друг от
друга (генетические
расстояния).
Slide 22
Генетическая карта
американской норки
включает 127 генов
(черный текст) и 39
микросателлитных
последовательностей
(красным текст).
Разным цветом
выделены районы
хромосом норки
гомологичные
хромосомным.
Slide 23
Преимущества
большое число консервативных групп
сцепления
создание банков клеточных культур
для локализации вновь возникшей
мутации к настоящему моменту есть
набор маркерных генов для каждой
хромосомы.
Slide 24
Построение
генетической карты
Шаг 1: формирование групп
сцепления генов и исследование их
взаимного расположения(Скрещивания
проводятся до тех пор, пока не удастся выявить
сцепленное наследование анализируемой
мутации с маркерными мутациями какой-либо
хромосомы)
Шаг 2: подсчитывание расстояния
между исследуемым геном и уже
известными маркерными генами
Slide 25
Единицы измерения
Генетическое расстояние между линейно
расположенными генами, выраженно в процентах
рекомбинации -
Два гена на хромосоме
находятся на расстоянии 1
сМ, если вероятность
рекомбинации между ними
в процессе мейоза
составляет 1%.
Классический пример Моргана –
расстояния между генами
дрозофилы
Slide 26
4 степени надежности
локализации данного гена
подтвержденная (установлена в двух и
более независимых лабораториях или на
материале двух и более независимых тестобъектов),
предварительная (1 лаборатория или 1
анализируемая семья),
противоречивая (несовпадение данных
разных исследователей),
сомнительная (не уточненные
окончательно данные одной лаборатории)
Slide 27
Минусы:
частота рекомбинации в
разных точках генома
различна, и расстояние
может существенно
варьировать
Необходим
тщательный
анализ
родословной
(если
картируется ген
заболевания)
в результате карты
сцеплений не отражают
реальных физических
расстояний между
маркерами и генами
на хромосомах.
Slide 28
Цитогенетическое
картирование
осуществляется с применением
методов цитогенетики, когда для
локализации каких-либо
нуклеотидных
последовательностей и
определения их взаимного
расположения используются
цитологические препараты
Slide 29
Цитологические карты
Метод цитологических карт основан на
использовании хромосомных перестроек –
перекрывающихся делеций.
При облучении и действии других
мутагенов в хромосомах часто
наблюдаются потери (делеции)
или вставки (дупликации)
небольших фрагментов,
сравнимых по величине с одним
или несколькими локусами.
Slide 30
Принципы:
Используются гетерозиготы по хромосомам, одна из которых
будет нести группу следующих друг за другом доминантных
аллелей, а гомологичная ей - группу рецессивных аллелей тех же
генов.
Если в хромосоме с доминантными генами произошла утрата
отдельных генов, например DE, то у гетерозиготы ABC/abcde будут
проявляться рецессивные признаки de. На этом принципе основан
метод перекрывающихся делеции, используемый при построении
цитологических карт.
Slide 31
Методы
дифференциального
окрашивания позволяют
идентифицировать на
препарате как отдельную
хромосому, так и любой
участок хромосомы
Разработанный на дрозофиле
специальный метод
перекрывающихся делеций был
использован для
цитологического картирования
генов у представителей многих
видов.
Slide 32
Хромосомные комплексы китайского хомячка
(А), мыши (Б) и их соматического гибрида (В)
Slide 33
Сравнение генетических и
цитологических карт хромосом
показывает их соответствие:
чем больший процент
кроссинговера разделяет пару
генов, тем больше и физическое
расстояние между ними.
Slide 34
Запись локализации
гена
Согласно официально утвержденной номенклатуре
(ISCN,1978), каждая хромосома человека после
дифференциальной окраски может быть разделена на
, нумерация которых начинается от
центромеры вверх (
), либо вниз
).
в каждом
участке тоже нумеруются в аналогичном порядке. Крупные
полосы разделяются на более мелкие
Slide 35
Slide 36
Алгоритм решения
задач на картирование
генов
Slide 37
Пример:
Составьте карту хромосомы,
содержащую гены, если
частота кроссинговера между
генами и равна 2,5%, и -
3,7%, и -6%, и - 2,8%, и -
6,2%, и - 15%, и - 8,8%
Slide 38
Slide 39
Используемая
литература
Э. Р. Рахманалиев, Е. А. Климов, Г. Е. Сулимова МЕТОДЫ
КАРТИРОВАНИЯ ГЕНОМОВ МЛЕКОПИТАЮЩИХ.
КАРТИРОВАНИЕ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ РАДИАЦИОННЫХ
ГИБРИДОВ (RH КАРТИРОВАНИЕ)
Аксенович Т.И. Проблемы картирования QTL (Институт
цитологии и генетики СО РАН, Новосибирск)
Мяндлина Г.И. Молекулярные основы медицинской
генетики(кафедра биологии и общей генетики,
медицинского факультета РУДН)
В.И. Иванов Генетика Учебник для вузов, 2006
1.1. При цитологическом картировании изучение дифференциально окрашенных хромосом позволяет обнаружить крупные хромосомные перестройки путем сравнения исследуемого образца с контрольным.
1.1.1. Гибридизация in situ: ISH- и FISH- гибридизация
Прямым методом картирования генов на хромосоме является метод гибридизации нуклеиновых кислот. Вариации метода (гибридизация in situ - на месте) и FISH используются в тех случаях, когда имеются пробы, или зонды с известными (секвенированными) нуклеотидными последовательностями. Зонды - это искусственно синтезированные меченые: радиоактивными изотопами или флуоресцентными красителями - химически небольшие (10-30 нуклеогидов) сегменты одноцепочечной ДНК (или РНК), комплементарные искомому гену. Эти короткие олигонуклеотиды соединяются только с тем участком ДНК, который содержит последовательность нуклеотидов, строго соответствующую (комплементарную) последовательности нуклеотидов зонда. Следовательно, наличие связавшейся с ДНК метки с высокой точностью свидетельствует о присутствии в анализируемом образце искомых последовательностей нуклеотидов.
Локусы генов, комплементарные зондам, могут быть картированы непосредственно на хромосоме путем регистрации радиоактивной метки.
1.1.2. Хромосомный пейнтинг
Одним из наиболее разрешающих методов является многоцветная флуоресцентная гибридизация или хромосомный пейнтинг (хромосомная живопись). Для получения многоцветных изображений используют различные флуорохромы, которыми метят разные зонды ДНК. Информация об интенсивности свечения каждого флуорохрома записывается на компьютере отдельно и каждому из таких изображений присваивается свой собственный псевдоцвет.
1.1.3. Гибридизация соматических клеток
При цитологическом картировании используется также гибридизация соматических теток. В условиях культуры можно получить соматические гибриды клеток человека и различных грызунов: человек - мышь, человек - крыса, человек - хомяк. Так, к 2002 году был полностью изучен геном мыши. Оказалось, что многие гены в геноме мыши гомологичны по структуре генам человека.
1.2. Генетическое картирование
Генетические карты - это карты-схемы взаимного расположения генов на индивидуальных хромосомах, т.е. находящихся в одной группе сцепления.
Принципы генетического картирования были впервые разработаны Т. Морганом. Им же была составлена первая генетическая карта X-хромосомы дрозофилы, основанная на учете частоты образования кроссоверных и некроссоверных гамет у самок, гетерозиготных по рецессивным мутациям, локализованным в Х-хромосоме. Так. в мейозе гетерозиготных самок кроссинговер между генами у (желтое тело) и w- (белые глаза) происходил в 1,5% случаев, между генами w и m (миниатюрные крылья) -34,5%, а между генами у и т - 36% случаев.
Генетические карты сцепления правильно отражают порядок расположения генов (или генетических маркеров) на хромосомах, однако расстояния между ними имеют относительные значения, т.е. не соответствуют реальным физическим расстояниям.
1.3 . Молекулярные маркеры ДНК и их использование для генетического картирования
1.3.1. ПДРФ - маркеры ПДРФ (полиморфизм длин рестрикционных фрагментов ДНК,
Было установлено, что генетическим маркером может быть любое место в геноме, где произошло изменение в последовательности ДНК, которое обнаруживается как внутреннее различие между индивидами в популяции, но никаких внешних (фенотипических; различий между ними при этом не наблюдается.
У бактерий установлен и выделен целый ряд ферментов рестриктаз, которые узнают специфические последовательности в молекуле ДНК (обычно составляющие 4-6 нуклеотидов) и разрезают двойную спираль внутри или вблизи сайта узнавания, в результате чего образуются рестрикционные фрагменты, или рестрикты.
Отсутствие сайта узнавания может быть связано с делецией. инсер-цией или заменой нуклеотидов. Следовательно, любая мутация, изменяющая последовательность нуклеотидов сайта рестрикции, уничтожает этот сайт.
1.3.2. Молекулярные маркеры, основанные на полимера гной цепной реакции (ПЦР-маркеры)
Принципы метода ПЦР. Полимеразная цепная реакция имитирует природный процесс воспроизведения (удвоения) ДНК - репликацию, происходящую на матричной основе (по принципу комплементарности) с участием фермента ДНК-полимеразы. Но если во время репликации удваивается вся ДНК, то при ПЦР - происходит многократное копирование (воспроизведение, амплификация) лишь интересующего исследователя специфического, небольшого фрагмента, расположенного между двумя праймерами.
1.3.3. Микросателлиты и минисателлиты как молекулярные маркеры
Разновидностями сатДНК являются.микросателлиты (МКС, или простые повторяющиеся последовательности - ППП) и минисателлиты (МНС). Минимальная повторяющаяся единица (КОР) микросателлитов включает от 1 до 10 пар нуклеотидов, минисателлитов - 15 -70 пн. Их расположение в геноме и число повторений коровых единиц специфичны для каждого организма.
1.4. Физическое картирование
Физическое картирование основано на прямом анализе молекул ДНК. составляющих каждую хромосому (без анализа результатов скрещивания). Его конечная цель -определение последовательности нуклеотидов в каждой хромосоме
1.4.1. Создание рестрикционных карт
Рестрикционное картирование основано на установлении точек действия различных рестриктаз. Распределение сайтов рестрикции представляет собой своеобразный паспорт каждого фрагмента ДНК и может использоваться для его идентификации.
Банк генов. Для этого фрагменты ДНК организма присоединяют к векторным молекулам, т.е. молекулам-переносчикам чужеродных генов. В качестве векторов используют плазмиды бактерий, фаги (вирусы, инфицирующие бактерии), космиды (гибридные молекулы, полученные из ДНК фага К и бактериальной плазмиды; благодаря наличию cos-участка фага А., который обеспечивает замыкание его линейной ДНК в кольцо, космидная ДНК, включившая чужеродные гены, может быть упакована в головку бактериофага). В качестве векторов используют также искусственные хромосомы дрожжей YAK - (ЯК) и бактерий ВАС - (БАК) хромосомы.
1.4.2. Создание упорядоченных библиотек клонов. Карты контиг.
Процедура "Прогулка по хромосоме"
Чтобы установить порядок расположения клонов (т.е. клонированных фрагментов ДНК) на хромосоме (по ее длине), необходимо выявить участки их частичного перекрывания. Это можно сделать путем гибридизации нуклеиновых кислот, если известна нуклеотидная последовательность хотя бы одного фрагмента. Его метят радиоактивно или флуорохромом и используют в качестве зонда для создания упорядоченных библиотек клонов.
"Прогулка по хромосоме" (скользящее зондирование). Для упорядочивания клонов используют две разные библиотеки геномной ДНК, полученные из ДНК одного и того же организма, но разделенные двумя разными рестриктазами. Если один из генов (или клонов) в первой библиотеке удалось картировать и клонировать (т.е. получить из него ДНК-маркирующий сайт - STS), он затем может быть использован в качестве зонда для выявления перекрывающегося клона во второй библиотеке. А изученный клон второй библиотеки может использоваться как зонд для другого перекрывающегося фрагмента первой библиотеки и т.д.
Таким образом устанавливается порядок расположения клонов на хромосоме.
1.4. Определение нуклеотидной последовательности генома (секвенирование ) Исчерпывающая физическая карта генома человека (и любого другого организма) должна представлять собой полную последовательность нуклеотидов ДНК всех его хромосом.
1.5. Кандидатное картирование
В рамках этих подходов картировать ген означало пройти путь от его функции к локализации на хромосоме (позиции).
Генетическое картирование. Методы картирования генов. Севостьянова Наталия Владимировна доктор медицинских наук, Профессор кафедры биологии и генетики
Слайд 2
План лекции Картирование генов. Хромосомные карты. Цитологические карты. Методы картирования генов. Тестирование мутаций на аллелизм. Хромосомные мутации.
Слайд 3
Генетическое картирование - это определение положения картируемого гена относительно других генов данной хромосомы. Чем больше генов известно у данного вида, тем точнее результаты.
Слайд 4
Генетическая карта хромосомы это схема взаимного расположения генов, находящихся в одной группе сцепления. Как известно, у D. melanogaster в диплоидном наборе четыре пары хромосом.
Слайд 5
Составить такую карту можно только для объектов, у которых изучено большое число мутантных генов Например, у дрозофилы идентифицировано свыше 500 генов, локализованных в 4 группах сцепления. I группа - половые хромосомы (XX - самки, XY - самцы), II, III, IV - аутосомы.
Слайд 6
У кукурузы - свыше 400 генов, распределенных в 10 группах сцепления
Слайд 7
Для составления генетических карт хромосом необходимо выявление множество мутантных генов и проведения многочисленных скрещиваний.
Слайд 8
Генетические карты хромосом составляют для каждой пары гомологичных хромосом. Группы сцепления нумеруют последовательно, по мере их обнаружения. Также указывают полные или сокращённые названия мутантных генов, их расстояния в морганидах. Обозначают место центромеры.
Слайд 9
У менее изученных объектов число обнаруженных групп сцепления меньше гаплоидного числа хромосом. У бактерий, которые являются гаплоидными организмами, имеется одна, чаще всего непрерывная, кольцевая хромосома и все гены образуют одну группу сцепления. Генетическая карта хромосомы кишечной палочки.
10
Слайд 10
Методы картирования генов Физические определение с помощью рестрикционных карт электронной микроскопии вариантов электрофореза межгенных расстояний – в нуклеотидах Генетические определение частот рекомбинаций между генами, в частности, в семейном анализе и др. Цитогенетические гибридизации in situ получение монохромосомных клеточных гибридов делеционный метод и др.
11
Слайд 11
Тестирование мутаций на аллелизм Функциональный тест на аллелизм, который позволяет определить, принадлежат ли мутантные аллели одному локусу или разным. Получают гибридов (гетерокарионов), у которых две исследуемые мутации находятся на разных гомологичных хромосомах - Транс-положение.
12
Слайд 12
Если обе мутации действуют на разные независимые функции (затрагивают два разных гена), то такой гибрид имеет дикий фенотип, так как образуется дигетерозигота, в которой нормальные аллели доминируют над мутантными. Если исследуемые мутации действуют на одну и ту же функцию (повреждают один и тот же ген), то гибрид должен иметь мутантный фенотип.
13
Слайд 13
Цис-тест - получают гибридов, у которых обе исследуемые мутации привнесены одним из родителей, тогда как в хромосомах других содержатся нормальные аллели. Гибриды с цис-положением мутаций должны иметь фенотип дикого типа независимо от того, относятся ли исследуемые мутации к одному или разным генам. Это причина редкого использования цис-теста.
14
Слайд 14
Для построения генетической карты хромосомы эукариот используют мейотический и митотический кроссинговер. Сравнение генетических карт хромосом, построенных разными методами у одного и того же вида, выявляет одинаковый порядок расположение генов, хотя расстояние между конкретными генами на мейотических и митотических генетических картах хромосом могут различаться. Некоторые из таких ошибок можно наблюдать, используя цитогенетические методы
15
Слайд 15
Мейотический кроссинговер - это сложный процесс, в ходе которого возможны ошибки. Кроссоверный обмен осуществляется по типу разрыв-воссоединение. Цитологической иллюстрацией этого механизма может служить мейотический кроссинговер между разноокрашенными сестринскими хроматидами. Иногда воссоединение хроматид происходит неправильно, и это может приводить к образованию дицентрических хромосом и ацентрических фрагментов.
16
Слайд 16
В норме генетические карты хромосом у эукариот линейные. При построении генетических карт хромосом у гетерозигот по транслокации получается генетическая карта хромосом в виде креста. Это указывает на то, что форма карт отражает характер конъюгации хромосом.
17
Слайд 17
Кроссоверные обмены с ошибками воссоединения хроматид называются U-обменами. U-обмены обнаружены у многих видов растений и животных. Наиболее подробно они изучены у ржи (Jones, Brumpton,1971). Частота U-конфигураций у ржи может достигать 30-40% на клетку, или 4-5% на бивалент. Частота несестринских U-обменов значительно выше, чем сестринских. Неправильное воссоединение хроматид может быть одним из факторов, приводящих к образованию несбалансированных гамет.
18
Слайд 18
Цитологическая карта составляется на основании изучения политенных хромосом, что позволяет сопоставить структуру синтезируемого белка с определенным участком хромосомы (геном), так как транскрибируемый участок определяется под микроскопом в виде пуфа. Это позволяет определить локализацию гена.
19
Слайд 19
Цитологическая карта хромосомы представляет собой фотографию или точный рисунок хромосомы, на котором отмечается последовательность расположения генов. Ее строят на основе сопоставления результатов анализирующего скрещивания и хромосомных перестроек. Например, если хромосома с доминантными генами будет последовательно терять отдельные локусы (при воздействии на нее мутагенов), то в гетерозиготе начнут проявляться рецессивные признаки. Порядок проявления признаков будет указывать на последовательность расположения генов.
20
Слайд 20
Метод цитологических карт основан на использовании хромосомных перестроек. При облучении и действии мутагенов в хромосомах часто наблюдаются потери (делеции) или вставки (дупликации) небольших фрагментов, сравнимых по величине с одним или несколькими локусами. Например, можно использовать гетерозиготы по хромосомам, одна из которых будет нести группу следующих друг за другом доминантных аллелей, а гомологичная ей - группу рецессивных аллелей тех же генов ABCDE /abcde. Если в хромосоме с доминантными генами произошла утрата отдельных генов, например DE, то у гетерозиготы ABC/abcde будут проявляться рецессивные признаки de. На этом принципе основан метод перекрывающихся делеции, используемый при построении цитологических карт!!!
21
Слайд 21
Цитогенетические карты хромосом составляются на основе дифференциальной окраски (темные и светлые полосы) и картирования генов в отдельных локусах хромосом.
22
Слайд 22
Цитогенетические карты дают информацию о расположении гена на хромосоме относительно ее участков, идентифицируемых методами дифференциального окрашивания. Благодаря такому окрашиванию хромосома в поле зрения микроскопа выглядит «поперечно исчерченной».
23
Слайд 23
Расположение окрашенных участков (бэндов) специфично для каждой хромосомы.
24
Слайд 24
Использование FISH-метода позволяет построить цитогенетические карты с разрешением 2-5 Мб, а его модификации для интерфазных хромосом - 0, 1 Мб. Таким образом, локализация картированного с помощью FISH-метода гена может быть установлена с точностью до субсегмента и локусабэнда.
25
Слайд 25
Картирование генов с помощью хромосомных мутаций Внутрихромосомные мутации – преобразование генетического материала в пределах одной хромосомы. Межхромосомные – перестройки, в результате которых две негомологичные хромосомы обмениваются своими участками. Хромосомные мутации – это изменения в структуре хромосом
26
Слайд 26
Инверсии Инверсии - хромосомные перестройки, связанные с поворотом отдельных участков хромосомы на 180°, были открыты А. Стёртевантом в 1926 г.
27
Слайд 27
Парацентрическая инверсия – происходят два разрыва хромосом, оба по одну сторону от центромеры. На участке между точками разрыва происходит поворот 180. Перицентрическая инверсия – точки разрывов расположены по обе стороны от центромеры.
28
Слайд 28
У особей, гетерозиготных по инверсии, в хромосомах образуется петля. У гомозиготных особей по инверсиям кроссинговер происходит без изменений.
29
Слайд 29
У гетерозиготных особей по парацентрической инверсии происходит «запирание» кроссинговера следующим образом: в случае перекреста между генами С и D образуются два продукта: ацентрические хромосомы и дицентрические хромосомы, т. е. без центромеры и с двумя центромерами соответственно. Обе комбинации летальны.
30
Слайд 30
Дицентрик образует «хромосомный мост» в анафазе 1 мейоза, который виден под микроскопом. Обе комбинации летальны. Таким образом, в результате кроссинговера образуются нежизнеспособные гаметы, и потомства нет.
31
Слайд 31
При перицентрической инверсии, в случае перекреста между генами С и Д, также получаются два продукта. Дупликация А и делеция F. Каждая из полученных хромосом несет дупликацию одного неинвертированного района хромосом и делецию другого. В результате такие гаметы нежизнеспособны и кроссоверы не выявляются. Так же как и парацентрические, перицентрические инверсии «запирают» кроссинговер. Поскольку кроссинговер в инвертированном участке хромосомы «заперт », в нем могут формироваться блоки мутаций, отличные от тех, которые локализованы в гомологичном фрагменте хромосомы, но не инвертированном. Это явление называют инверсионный полиморфизм популяций.
32
Слайд 32
Хромосомы с множественными инверсиями используют при создании балансеров, т. е. линий, позволяющих поддерживать летальные мутации и мутации по плодовитости. Один из примеров - линия С L В. Более надежными балансерами, т. е. содержащими несколько инверсий, являются линии Base, Binsn. Конструирование балансерных хромосом по существу представляет собой первый пример генетической инженерии. Другой пример балансеров - линия Су (загнутые крылья, летальность), в которой доминантная мутация сопряжена с длинной инверсией, захватывающей почти всю вторую хромосому. В потомстве от скрещивания гетерозигот по Су выживают только мухи родительских классов, т. е. линия сбалансирована, и исследуемая леталь /, постоянно в ней поддерживается в гетерозиготном состоянии.
33
Слайд 33
Использование делеций для локализации генов было названо методом делеционного картирования. Делеции Делеция – утрата участка хромосомы. Делеции были открыты в 1917 г. К. Бриджесом генетическими методами. В нормальной хромосоме гены расположены в определенном порядке: tABCDEF При потере фрагмента хромосомы возможны два принципиальных варианта: ABEF или ABC т. е. может быть потеряна средняя или концевая часть хромосомы.
34
Слайд 34
Транслокации Хромосомные перестройки, в результате которых часть хромосомы переноситься в другое место этой же хромосомы или на другую хромосому. Но общее число генов не меняется!!! Транслокации были открыты К. Бриджесом в 1923 г. у дрозофилы.
35
Слайд 35
Внутрихромосомные транслокации возникают в результате образования трех разрывов и перенесения хромосомного сегмента в другой район той же хромосомы. Межхромосомные реципрокные транслокации возникают в результате образования двух разрывов и обмена участками негомологичных хромосом.
36
Слайд 36
Две хромосомы в результате реципрокного обмена фрагментами образуют гетерозиготную транслокацию. Если образуются три разрыва и фрагмент хромосомы удаляется из одной хромосомы и встраивается в другую - это инсерционная транслокация.
37
Слайд 37
Самым ярким примером, когда с помощью транслокации был картирован ген, является миопатия Дюшенна. Ген миопатии Дюшенна локализован в X хромосоме и обычно проявляется тяжелой миопатией у мальчиков. Однако обнаружили несколько случаев типичной клинической картины миопатии у женщин. Они оказались связанными с транслокациями между хромосомой X и аутосомами, причем в хромосоме X разрыв всегда локализовался в районе Хр21.
38
Слайд 38
Картирование гена иногда может быть достигнуто за счет использования эффекта дозы гена. В случае делеции следует ожидать уменьшение на 50 % продукта гена (это прежде всего может быть фермент). Именно таким способом был картирован ген кислой фосфатазы эритроцитов в хромосоме 2.
